Blog

1.º Por que razão a centrifugação afeta os resultados das experiências celulares?

A centrifugação é amplamente utilizada em cultura celular, recolha de células e preparação de amostras biológicas para separar as células dos meios de cultura, obter *pellets* celulares e preparar amostras para análises posteriores. Condições de centrifugação ou procedimentos de manuseamento inconsistentes podem resultar numa recuperação celular variável, *pellets* pouco compactados ou presença de células residuais no sobrenadante.

Estes problemas não são, necessariamente, causados pela própria centrífuga. As características da amostra, a força centrífuga relativa (FCR), o tempo de centrifugação, a temperatura, a configuração do rotor e as técnicas de ressuspensão podem influenciar o resultado.

Assim sendo, a investigação de problemas deve ter em conta a amostra, o objetivo experimental e todo o fluxo de trabalho, em vez de considerar apenas a velocidade de rotação.

2. Controlo da temperatura: Adequar as condições aos requisitos da amostra

A rotação do rotor a alta velocidade pode gerar calor através das perdas mecânicas e da resistência do ar. No caso de células e materiais biológicos sensíveis à temperatura, o controlo térmico pode afetar a integridade da amostra. Contudo, a centrifugação refrigerada não é necessária para todas as amostras.

Práticas fundamentais:

●Confirme os requisitos de temperatura: Siga um protocolo validado, adequado ao tipo celular e à amostra.

●Efectue o pré-arrefecimento, quando necessário: Aguarde o tempo suficiente para que a centrífuga atinja as condições de funcionamento desejadas, seguindo as instruções do fabricante.

●Minimize atrasos desnecessários: Mantenha a consistência no manuseamento das amostras antes e depois da centrifugação, especialmente no caso de materiais sensíveis à temperatura.

●Registe os parâmetros relevantes: No caso de os resultados variarem entre diferentes lotes, compare a temperatura, o tempo de centrifugação e o tempo de manuseamento das amostras.

Temperaturas mais baixas não melhoram, por si só, a viabilidade celular. A configuração adequada depende da amostra e do objetivo experimental.

3. Equilibragem do rotor: Garanta um funcionamento seguro e estável

A distribuição desigual da massa entre os tubos de centrífuga gera um desequilíbrio durante a rotação. Isto pode causar vibração e aumentar o esforço mecânico sobre o rotor, o sistema de acionamento e os recipientes de amostra. Um desequilíbrio acentuado pode desencadear uma paragem de segurança ou danificar o equipamento.

Práticas fundamentais:

● Carregue as amostras de forma simétrica, seguindo as instruções do fabricante do rotor.

● Equilibre os tubos com base na massa, em vez de considerar apenas o nível do líquido.

● Verifique se os tubos, tampas e adaptadores são compatíveis com o rotor e com as condições de funcionamento pretendidas.

● Siga as exigências do fabricante para o carregamento no caso de o rotor ser utilizado apenas parcialmente cheio. Não presuma que um qualquer tubo vazio ou um contrapeso servem para este fim.

Caso ocorra vibração ou ruído invulgar, ou seja acionado um alarme durante o funcionamento, interrompa o funcionamento da centrífuga de forma segura e aguarde até que o rotor pare completamente antes de inspecionar a carga, a instalação do rotor e a compatibilidade dos tubos. Nunca mantenha a centrífuga em funcionamento na tentativa de eliminar uma vibração anormal.

O equilíbrio do rotor serve, primordialmente, para proteger o equipamento e garantir um funcionamento estável. Por si só, não assegura a viabilidade celular nem a pureza da amostra.

4. Aceleração e desaceleração: Equilibre a qualidade da separação e a eficiência

As definições de aceleração e desaceleração afetam o tempo necessário para atingir ou sair da velocidade desejada. Dependendo da amostra, podem também influenciar a estabilidade do precipitado (pellet) ou a integridade de uma interface de separação.

Acelerações ou desacelerações rápidas não danificam, necessariamente, as células. As configurações adequadas dependem das características da amostra, do design do rotor e do protocolo experimental validado.

Para amostras com precipitados pouco compactados ou interfaces de separação sensíveis, um perfil de desaceleração mais gradual pode ajudar a reduzir as perturbações. Para a colheita de células de rotina, as configurações devem seguir condições estabelecidas e adequadas à aplicação em causa.

Caso os precipitados se apresentem mal formados, o sobrenadante permaneça turvo ou a recuperação varie entre corridas, analise conjuntamente a RCF (força centrífuga relativa), o tempo de centrifugação, as condições da amostra e as definições de desaceleração. Uma comparação controlada, mantendo-se as restantes condições constantes, é mais fiável do que atribuir o resultado a um único parâmetro.

5. Tempo e força de centrifugação: vá além das RPM

O tempo de centrifugação influencia a extensão da sedimentação. Um tempo insuficiente pode deixar as células de interesse em suspensão; contudo, o simples prolongamento da duração do processo não é uma solução universal. As condições adequadas dependem, também, das propriedades da amostra, da força centrífuga, da geometria do rotor e do tipo de separação desejada.

RPM vs. RCF: Qual é a diferença?

RPM (rotações por minuto) refere-se à velocidade do rotor, enquanto RCF (força centrífuga relativa) descreve a aceleração a que a amostra é sujeita em relação à gravidade. A RCF depende tanto da velocidade de rotação como do raio efetivo do rotor.

Por exemplo, a 3000 rpm, um rotor com um raio efetivo de 10 cm gera aproximadamente 1006 × g, enquanto que um rotor com um raio efetivo de 15 cm gera aproximadamente 1509 × g. Portanto, um mesmo valor de RPM não produz, necessariamente, a mesma força centrífuga.

Quando transferir um protocolo para outra centrífuga ou rotor, não presuma que o valor de RPM original reproduzirá as mesmas condições de separação.

Recomendações práticas:

● Se o protocolo especificar a RCF, utilize-a como referência principal quando verificar as condições de funcionamento.

● Quando trocar de rotor, verifique o raio efetivo e a compatibilidade dos tubos e adaptadores.

● Se apenas for fornecido o valor de RPM, confirme as especificações do rotor original antes de converter o parâmetro.

● Valide o tempo de centrifugação com base nos resultados experimentais, em vez de simplesmente o aumentar sem verificação prévia.

Siga sempre o protocolo validado e respeite os limites de funcionamento estabelecidos pelo fabricante da centrifugadora.

6. Preparação das amostras: Mantenha as condições iniciais consistentes

A centrifugação não consegue compensar inconsistências introduzidas durante a preparação da amostra. A distribuição irregular das células, a agregação, as diferenças no volume da amostra e os atrasos no processamento podem, todos, afetar a recuperação.

Práticas fundamentais:

●Uniformizar a homogeneização: Utilize um método adequado à amostra e evite agitação vigorosa desnecessária ou pipetagem excessiva.

●Controle o volume da amostra: Respeite os limites de carga dos tubos e rotores, e confirme a compatibilidade com o equipamento selecionado.

●Inspecione o estado da amostra: Avalie a presença de agregados, bolhas ou partículas visíveis, quando pertinente. A filtração e a remoção de bolhas não são adequadas para todas as amostras e podem resultar na perda do material de interesse em alguns fluxos de trabalho.

●Controle o tempo de processamento: Para amostras sensíveis ao tempo, mantenha o intervalo entre a colheita, a preparação e a centrifugação o mais consistente possível.

A preparação da amostra deve ser adaptada ao tipo de amostra e ao objetivo experimental, em vez de aplicar os mesmos passos adicionais a todos os fluxos de trabalho.

7. Solução de problemas comuns em centrifugação

Quando ocorrer um resultado inesperado, registe primeiro a observação e, em seguida, analise as possíveis causas de forma sistemática. Evite alterar vários parâmetros ao mesmo tempo.

Estas observações podem ter múltiplas causas. Interprete-as no contexto da amostra, da configuração do equipamento e dos registos experimentais, em vez de tirar conclusões a partir de um único sintoma.

8.º Padronizar os registos de centrifugação

O registo consistente dos dados facilita a comparação entre lotes experimentais, a identificação de variações e a reprodução de condições bem-sucedidas.

Quando os resultados divergirem das expectativas, compare a execução atual com registos de experiências bem-sucedidas. Sempre que possível, altere uma variável principal de cada vez e utilize experiências de replicação adequadas para avaliar o seu efeito.

9. Como escolher a centrífuga ideal para a sua aplicação

● A escolha de uma centrífuga deve ter em conta o tipo de amostra, a RCF (força centrífuga relativa) necessária, o volume de processamento, as exigências de temperatura, a compatibilidade com o rotor e a capacidade de processamento — e não apenas a rotação máxima (RPM).

● Centrífugas de baixa velocidade: adequadas para a recolha de células de rotina e separações básicas, dentro do intervalo de funcionamento do equipamento.

● Centrífugas refrigeradas: indicadas para fluxos de trabalho que exijam controlo de temperatura.

● Centrífugas de alta velocidade: concebidas para aplicações que exigem forças centrífugas mais elevadas, respeitando os limites especificados para o equipamento e para o rotor.

● Centrífugas de grande capacidade: adequadas para fluxos de trabalho que envolvam volumes de amostras mais elevados ou uma procura de processamento mais intensa.

Antes de selecionar um sistema, analise as opções do rotor, a velocidade máxima permitida, a gama de RCF, o controlo da temperatura, as definições de aceleração/desaceleração e as características de segurança.

A Welso oferece centrífugas que satisfazem diversas necessidades de processamento de amostras em laboratório. O modelo ideal deve ser avaliado com base na aplicação pretendida, na configuração do rotor e nas especificações técnicas. A obtenção de resultados fiáveis depende também do balanceamento correto, da definição de parâmetros operacionais adequados e do manuseamento consistente das amostras.

Conclusão

A centrifugação celular fiável depende das características da amostra, da configuração do equipamento, dos parâmetros de funcionamento e do fluxo de trabalho de manuseamento associado. O controlo da temperatura, o equilíbrio do rotor, a aceleração e a desaceleração, o tempo de centrifugação e a preparação da amostra são fatores relevantes quando se investigam resultados inconsistentes.

Quando a recuperação celular, a formação do *pellet* ou a viabilidade sofrem alterações inesperadas, deve-se avaliar todo o fluxo de trabalho, em vez de assumir que um único parâmetro é o responsável. Procedimentos padronizados, registos consistentes e uma validação controlada podem auxiliar os laboratórios a identificar fatores contribuintes e a melhorar a reprodutibilidade do processamento celular.